Oligo怎么查看GC含量 Oligo GC含量过高怎么调整

设计PCR引物的时候，要是只盯住GC含量这么一个百分比，那很容易会把事情想简单了。在Oligo里面，查看GC含量具体该怎么操作，碰到GC含量太高又该怎么往下调，这两件事还得把Tm值、引物长度、3‘末端的稳定性，还有会不会形成二级结构，都拢到一块儿去判断才行。下面就以Oligo 7这个版本来讲一讲，其它版本菜单的位置也许会有一点点出入。Oligo本身可以拿来设计PCR引物，也可以设计测序引物和探针，顺带着还能帮你去查看引物序列的碱基组成、熔解温度，以及那些悄悄藏着的二级结构。

一、Oligo怎么查看GC含量

在Oligo里查看一条引物的GC含量，头一步是先把你准备分析的那条引物给选中，然后去打开序列组成的窗口，这一步顺序别弄反。只想看整段模板序列的GC比例是不行的，那个百分比不能直接往引物身上套。

1、打开目标序列

启动好Oligo以后，把DNA序列给导进来，或者在序列显示的那个窗口里头，直接把你正盯着的目标片段粘贴上去也可以。接着有一件事得先确认清楚，就是序列摆放的方向对不对，还有你到底打算扩增哪一块区域，正向引物和反向引物这两条，要一条一条分开去看，别混在一堆。

2、选中需要分析的引物

在软件列出来的一堆候选引物里头，用鼠标去点一下Forward Primer或者Reverse Primer，要是你只关心当前正操作的那一条，那选中Current Oligo也行。万一给出的引物数目比较多，不用着急，先靠它们所待的位置和长度把范围圈得小一点，然后再一条一条地放到一起比较。

3、打开组成分析窗口

顺着菜单栏往下找，点开【Analyze】这一项，再找到里面的【Composition&Tm】并点进去。这个窗口一弹出来，A、T、G、C这四种碱基各自出现了多少次，占了多少比例，就全都能瞧见了，同时G+C的总比例、A+T的总比例，还有用不同条件算出来的Tm值，也都会一行一行地列出来。Oligo 7在计算熔解温度的时候，会去用近邻法，也会用到GC比例法，所以你可能会瞧见不止一个Tm数值摆在上面。

4、同时对比两条引物

因为PCR引物是得成对儿上场的，所以正反两条引物不能拆开来各自单独下判断。除了各自把GC含量看明白以外，还需要把两条引物的Tm值摆到一起比一比，瞧瞧它们之间是不是差得有点多，另外长度上是不是比较接近，最后扩增出来的产物片段大小，是不是跟试验一开始就设想好的那个目标范围合得上。

二、Oligo GC含量过高怎么调整

GC含量要是算出来偏高，虽然引物抓模板会抓得牢靠一些，但麻烦事也会跟着冒出来，比方说Tm值容易被拉得很高，自己容易拧成发卡结构，或者两条引物互相配对的可能也跟着大了。做常规PCR的时候，不少人会把GC含量搁在40%到60%这么一个范围里当参考，不过你手里那条模板如果本身就是一个GC扎堆的地方，那也犯不着为了硬凑那个数字，把引物序列改得走了形。

1、向两侧移动引物位置

先在你原来圈定的那片区域附近，重新挑一下引物的起点或者终点，多数时候只用挪那么三五个碱基，就能把连成串的G或者C给拆散一些，而且你想要的那个扩增范围也能继续保住。

2、调整引物长度

如果引物本身设得偏长，那GC的个数自然也容易跟着攒多，这时可以试着把5‘那一头的序列削短一点，削完以后别忘了掉回头去，再把Tm值和特异性查一遍，看看有没有跟着变差。但是，千万别顺手去剪3’末端的碱基，因为那个位置会直接影响到聚合酶往上延展的效率，也跟错配的风险捆得很紧，随便去动它很不保险。

3、避开连续GC片段

要仔细在引物序列里面找找，看有没有连着好多个G或者C扎成堆的地方，尤其是靠3‘末端那个区域，如果GC一个紧挨着另一个排得太密，就很容易把二级结构和非特异的结合给招出来。做调整的时候，只要能保住一个差不多够用的GC稳定性就行，没必要让它们密密地堆在一块儿。

4、重新平衡正反向引物

等到你把其中一条引物单独改完了，一定别忘了把另一条也重新扯出来，摆到一块儿再比一回。正反两条引物的GC含量不一定非要一模一样，可Tm值之间拉开的差距最好是别太大，否则到了退火这一步，同一个温度很难把两条引物一块儿招呼好，扩增的效果就容易打折扣。

三、Oligo调整引物后还要检查什么

等GC含量被调到你觉得可以接手的程度了，也别急着就把序列发给公司去合成。Oligo这个软件本身还带着一些分析工具，能帮我们再查一查二级结构和可能错误引发的位置，所以这个时候最好趁热打铁，再跑上一轮完整的复核。

1、检查发卡结构

顺着菜单进到【Analyze】底下的【Hairpin Formation】，让软件帮你扫一遍引物自己是不是有形成稳定发卡结构的苗头。Oligo会把那些潜在可能拧起来的发卡，按稳定的程度一个一个排出来，并且附上它们对应的ΔG值和Tm值，这样一来你就能判断要不要绕开这些位置了。

2、检查引物二聚体

再去点开【Analyze】里面那个叫【Duplex Formation】的选项，这里头需要分两样东西来看：一个是引物自己跟自己配对会不会形成自二聚体；另一个是正向引物和反向引物之间互相配对的情形。最要当心的是3’末端，如果在那里冒出来连续互补的碱基，那就很可能在PCR过程中催生出引物二聚体，把正常的扩增产物给抢走一部分。

3、检查错误引发位点

还有一项，去点开【Analyze】菜单里面的【False Priming Sites】，让软件帮你探一探，引物除了在你想要的那个位置结合上去，是不是还容易溜去模板上别的地方，错误地引起合成。GC含量就算已经掉进了你觉得舒服的范围，也不代表特异性就自动合格了，要是模板上搁着一些重复的序列，这种地方尤其得把眼睛睁大一点仔细核对，千万别给漏过去。

总结

概括下来，在Oligo里面查看引物的GC含量，最直截了当的办法就是顺着【Analyze】→【Composition&Tm】这条路径去走，把G+C所占的比例和Tm值都仔细瞧上一遍。要是发现GC含量确实是偏高了，头一步先试着挪一挪引物在模板上的落脚点，接着再去调整引物的长度和那几段连成片的GC，改完之后要紧的是把正反两条引物重新拉到一起平衡一下。等到这些修改全都做下来以后，也还不能算完，还得把发卡结构、二聚体还有错误的引发位点，都挨个儿再查上一圈，这样做才能避免一头把GC百分比给压了下去，另一头却又丢下了新的扩增麻烦。