Oligo怎么做探针设计 Oligo探针特异性不足怎么优化

很多人以为，探针设计不过是从目标序列里选一小段寡核苷酸，但真正动手后，却常常碰到信号强度不够、背景偏高、同源区错配以及不同批次结果波动大这类麻烦。那么，在Oligo这款软件里，究竟该怎样去设计探针，以及在探针特异性不够理想时又该怎么优化呢？处理这些问题，需要把目标区间、解链温度、GC含量、二级结构和同源序列等因素综合起来考虑。按照Oligo 7手册的说法，特异性是评估引物和杂交探针质量的一个关键指标，同时软件也给出了像杂交探针、共有序列探针、TaqMan探针等多种搜索途径。

一、Oligo怎么做探针设计

在着手设计之前，先要准备好目标序列，同时明确这次设计的是普通杂交探针、TaqMan探针，还是分子信标。因为用途不一样，后面在软件里选择的搜索入口和筛选条件也会跟着调整。

1、导入目标序列

先把Oligo软件打开，通过【File】→【Open】菜单，将DNA或RNA的序列文件加载进来。如果只是想在某个外显子、突变位点或者保守区段附近来设计探针，那就别急着对一整条长长的序列进行全面搜索，而要先在序列窗口里，把目标位置的大致范围圈定下来。

2、进入探针搜索界面

随后，点开【Search】菜单，找到【Primers and Probes】，在里面挑选【Hybridization Probes】这一项，再点击一下【Search】按钮。这时候，Oligo会把那些符合初步筛选条件的候选探针，统统列在【Selected Oligonucleotides】窗口里面，而这些结果还可以根据它们在序列上的位置、解链温度以及其他字段重新排序。

3、限制搜索范围

接下来，点击【Ranges】按钮，把探针搜索的起止位置填进去。当处理的基因本身比较长的时候，先将候选范围压缩到目标区域附近，后面再筛结果会省力得多。要是遇到需要在一段基因的多个不连续片段上分别设计探针的情况，还可以利用‘Feature’功能，根据需要来挑选特定的区段。

4、查看候选探针参数

每选中一条候选探针，都要逐一核对它的解链温度、GC含量、是否存在碱基重复、会不会形成发夹结构，以及它与自身或其他序列结合成稳定双链的可能性有多大。至于探针的长度，也不要光靠以往的经验来定死，因为Oligo 7是支持在一个长度区间里进行搜索的，这样就能根据目标区域的真实情况，灵活地去做筛选。

二、Oligo探针特异性不足怎么优化

探针的特异性要是不理想，通常会表现为背景信号降不下来、在好几个位置上都能发生结合，甚至阴性对照样品里也冒出信号。这种时候，不要只想着去调探针的长度，而是应该先去看清楚，这条探针是不是刚好落在了重复序列区或者同源性很高的区域上。

1、避开重复序列

所以，那些包含连续重复碱基、低复杂度的片段，以及存在明显回文结构的候选探针，都应该优先删掉。因为这类重复区域，本身就容易在基因组的许多位置上发生非特异结合，就算后续再去优化反应的条件，想把背景水平彻底压下去也比较困难。

2、重新检查同源序列

如果设计的探针要同时覆盖好几个相近的序列，那就可以试试进入【Subsearches】子搜索功能，把【Consensus Probes】这个选项打开，再把那些相关的同源序列一起加进来，重新跑一次搜索。做完之后，Oligo会把比对出来的差异位置清晰地显示出来，这有助于我们判断，到底是哪几个碱基位点更容易出现错配。

3、调整Tm值和GC含量

解链温度设得太低，探针跟目标序列就结合得不够牢靠；可要是设得太高，非特异性的结合又会变得更难掌控。GC含量过高时，还得警惕局部的结构可能过于稳定，从而带来新的问题。因此，不要只去盯一个平均数值，更要把探针实际落入的序列位置，和它附近模板链的二级结构状态联系在一起看。

4、检查发卡和二聚体

另外，转到【Analyze】菜单下面，分别打开‘Hairpin Formation’和‘Duplex Formation’这两个选项，仔细查一查探针自身有没有形成发夹结构的倾向，会不会产生自二聚体，或者是否容易跟反应体系里的其他寡核苷酸缠在一起生成稳定的双链。当探针自身形成了很稳的结构，那能被用来跟目标序列去正确配对的比例自然就打了折扣。

三、Oligo探针结果怎么复核

等软件把筛选步骤跑完，还不能说事情就全做完了，最后必须由人来亲自复核一遍。因为探针在理论参数上看着合格，并不等于把它放进真实的实验体系里之后就一定表现得稳稳当当。

1、优先保留多个候选

比较稳妥的做法是，在同一个目标区域里，同时保留两到三条候选探针，而不是只留下软件评分排在最前面的那一条。这样一来，后面就能结合真实实验的结果，从信号强弱、背景高低，还有批次间的重复性这几个方面来做比较，最终更容易筛出最好用的那条。

2、核对探针所在位置

还要回过头去核实一下探针所处的具体位置，确认它有没有落到已知的突变堆积区、剪接差异位点，或者模板自身容易卷成稳定发夹结构的段落。一旦模板本身的空间构象比较复杂，就算探针的一级序列看上去一切正常，实际结合效率也可能会因此受到影响。

3、区分普通探针和TaqMan探针

如果是专门为实时定量PCR来设计探针，那么在进入【Primers and Probes】以后，就应该去选择【TaqMan Probes and PCR Pairs】这一项。Oligo是支持同时搜索探针和它配套的上下游引物组合的，并且还允许我们去调整探针跟引物之间解链温度的差值。

总结

归纳起来，用Oligo来设计探针，大致流程就是先导入序列，接着从【Search】菜单进入【Primers and Probes】，选定探针类型，限制好搜索的区间，然后再逐一检查解链温度、GC含量和二级结构这些参数。而当碰到探针特异性不够的情况时，优化的重点则要放在避开重复序列和同源区域上，同时重新审查发夹结构、二聚体和可能发生错配的那些位点，并且多留几条候选探针，依靠实际的实验数据来做最后的复核。说到底，软件能够帮助完成的是前期的筛选工作，但一条探针到底适不适合眼前的这套实验条件，最终还是得让实验结果来拍板决定。