Oligo引物设计怎么设置 Oligo引物Tm值偏差怎么调整

Oligo引物设计应当怎样设置，以及引物Tm值出现偏差时又该怎样去调整，这两个问题，在进行PCR、qPCR或者测序引物设计的时候，是经常会遇到的。设计引物这件事，不能只是去看软件自动给出的那几条推荐序列，还需要结合扩增的目标区域、产物的长度、GC含量、是否形成二聚体、有没有发卡结构，还有反应所用的体系，一起去做出判断。OLIGO 7这个工具本身，是支持PCR引物、测序引物、探针、多重PCR，还有实时PCR这些相关的设计和分析的，只不过软件给出的结果，仍然需要结合具体的实验条件，去进行复核。

一、Oligo引物设计怎么设置

在使用Oligo设计引物之前，需要先把实验的目的给明确下来。普通的PCR、qPCR、测序验证，还有多重PCR，它们对于引物的长度、产物的大小、Tm值的范围，以及特异性方面的要求，并不是完全一样的。如果最开始的目的，没有先确定清楚，那么到了后面，就算软件筛选出了很多备选的引物，也很难去判断出，到底哪一对才是更加合适的。

1、先把目标的序列导入进去

在Sequence这个界面里面，把目标DNA的序列给导入进去，然后再去确认一下序列的方向、长度，还有那一段待扩增的区域，是不是都正确的。到了这一步，需要特别留意的地方，是序列里面是不是包含了多余的接头、载体的片段，或者低质量的区域。目标序列一旦弄错了，那么后面所有的引物评分、Tm值，还有产物的位置，也就都会跟着一起跑偏。对于基因片段的扩增，还需要提前把需要覆盖的区域给标出来，避免让引物落在那一段并不想扩增的位置上面。

2、把引物的基础范围设置好

引物的长度、GC的含量、产物的长度，还有Tm值的范围，这几项都需要根据实验的类型，去进行设置。常规PCR所用的引物，一般不适合太短，也不适合把GC的含量弄得过高；qPCR则要更加关注产物的长度，和扩增的效率。Primer3这类常用的引物设计工具，也是会把Tm值、长度、GC含量、引物二聚体、产物大小，还有发生错配扩增的可能性，放在一起综合考虑的，这个思路，在Oligo的设置里面，也是同样适用的。

3、把二级结构的风险检查一下

候选的引物出来以后，不能只是去看评分最高的那一对，还要去看一看有没有形成发卡结构的可能，有没有自二聚体、互补二聚体，还有3末端互补的情况。3末端如果很容易互补的话，那么在扩增的过程当中，就更加容易形成引物的二聚体。就算Tm值看着是合适的，可要是二级结构的风险太高了，那也不建议直接就把它用到实验里面去。

二、Oligo引物Tm值偏差怎么调整

Tm值出现偏差这种情况，比较常见的，是在两种背景下面：一种是在软件里面，正向和反向引物的Tm值，彼此差距比较大；另一种，则是软件计算出来的Tm值，和实际表现出来的退火温度，对应不上。遇到这种情况，需要先分清楚，这到底是设计参数本身，所引起的偏差，还是因为反应体系的条件，和软件默认的那些条件，彼此不一致，才造成的偏差。

1、先把计算的条件统一起来

在跟Tm值计算相关的设置里面，去核对一下盐离子的浓度、镁离子的浓度、引物的浓度，还有计算所采用的方法，这几样东西，是不是都和实际的实验体系，比较接近。Tm值它并不是一个固定的常数，它会受到盐浓度、引物浓度、序列长度，还有计算模型，这好些个因素的影响。IDT关于Tm值的说明里面，也特别强调过，在计算Tm值的时候，应当把设置，更新到和实验条件相对应的状态以后，再去进行分析。要是软件默认的那些条件，和实际的实验体系，彼此相差很远，那么它显示出来的Tm值，自然也就和实际的退火表现，会出现偏差了。

2、调整一下引物的长度，还有GC的含量

如果某一条引物的Tm值，表现得偏低了，那就可以试着向外，延伸一到几个碱基，或者去挑选GC含量稍微高一些的位置；反过来，要是Tm值偏高了，那就可以把引物缩短一些，避开那些连续的GC区域，再或者，稍微移动一下引物的位置。正向和反向引物的Tm值，最好是能够比较接近的，不建议一条明显偏高，另一条又明显偏低，要不然的话，在退火的时候，就容易出现一端效率好，而另一端效率差的情况。

3、避开那些序列异常的区域

如果某一段区域，AT的含量特别高，GC的含量特别高，或者存在重复的序列、简单的重复，还有同源的片段，那么在这块区域里面，引物的Tm值，就容易变得不太稳定。碰到这种情况，不能只是硬着头皮去调整长度，而是应当试着把引物的位置，给挪动一下。尤其要注意的是，3末端要尽量避免连续的相同碱基，还有那种比较明显的互补序列，不然的话，到了后面，就容易出现非特异的扩增。

三、Oligo设计结果怎么复核更稳妥

Oligo筛选出来的引物，还只是处在备选阶段的一个结果，真正在去下单合成以前，还是要再进行复核的。有不少实验之所以会失败，倒并不是软件本身不会设计，而是使用的人，只去看了Tm值和产物的长度，却没有继续往下，去检查特异性、二级结构，还有实验的那些具体条件。

1、把候选的引物组合，复核一下

在整理候选引物表格的时候，最好是能够把正向引物、反向引物、Tm值、GC含量、产物长度、二聚体的风险，还有备注，这些信息，都给记录下来。这样做，要比只复制那两条序列，要更加稳当一些。后面万一实验的效果不够好，也还能回过头去，判断一下到底是Tm值不匹配，还是结构的风险偏高，又或者，是产物所在的区域本身，就不太合适。

2、结合上特异性的检查

引物设计完成了以后，还应当去结合数据库的比对，或者特异性的分析，来确认一下，是不是有可能会扩增出非目标的区域来。特别是在处理基因家族，或者重复序列比较多的物种的时候，光靠Oligo内部的评分，是不一定足够的，还需要去看一看，引物在基因组，或者目标数据库当中，相互匹配的情况。

3、用梯度PCR去验证退火的温度

如果Tm值调整了以后，心里面还是觉得没有把握，那就可以去使用梯度PCR的方法，来对退火的温度进行验证。软件给出来的Tm值，到底只是一个参考性质的数值，真正扩增的时候，还会受到酶、缓冲液、模板质量，还有循环程序，这一整套因素的影响。通过梯度实验，去把最佳的退火温度给确定下来，这比只是反反复复地去修改软件的参数，要更加可靠一些。

总结

Oligo引物设计应当怎样去设置，以及Oligo引物Tm值出现偏差时又该怎样去调整，这两件事的关键，是先把目标序列、产物的范围，还有设计的参数，都给设定清楚，然后再根据Tm值、GC含量、二级结构，还有特异性，去筛选出候选的引物来。遇到Tm值偏差的时候，不能只是去改动一个孤立的数值，而是需要同时去核对计算的条件、反应的体系、引物的长度，还有序列所在的位置。到了最后，还要再通过特异性的检查，和梯度PCR的验证，才能够让Oligo设计得到的结果，更加接近实验实际的需求。