Oligo引物二聚体怎么检查 Oligo引物二聚体评分过高怎么办

Oligo引物二聚体应当怎样检查，以及引物二聚体评分过高的时候又该怎样处理，这两个问题，在进行PCR、qPCR和测序引物设计的时候，是很常见的。引物二聚体这个问题，并不是单纯地“软件给出的提示不太好看”，它会和目标模板，去竞争反应体系里面的引物、酶，还有dNTP，要是情况比较严重，就会导致非特异性的条带出现、扩增的效率下降，或者是在qPCR的熔解曲线上，出现不太正常的小峰。在检查的时候，不能只是去看一个总的评分，而是需要把自身二聚体、互补二聚体、3’末端的互补情况，还有ΔG这些结果，放在一起进行判断。

一、Oligo引物二聚体怎么检查

在检查引物二聚体的时候，需要先区分一下，到底是单条的引物自身发生了互补，还是上下游的引物之间，发生了互补。自身的二聚体，主要就是去看同一条引物的内部，是不是能够相互配对；而互补的二聚体，则是去看正向引物和反向引物之间，是不是也很容易结合在一起。真正需要重点去关注的，通常都是3’末端连续互补的这种情况，因为这种结构，更加容易被聚合酶所延伸。

1、先把完整的引物序列输进去

在开始检查以前，需要先确认一下，输入进去的，就是最终要用于实验的那段引物序列，不要漏掉了酶切的位点、接头、标签的序列，或者是保护碱基。有不少时候，引物核心的结合区域，它本身是没有什么问题的，但是前面一旦加上了接头以后，整段序列的互补性，就变强了。如果实验当中，使用的是完整的引物，那么在进行检查的时候，也就应该使用完整的序列。

2、去查看二聚体分析的结果

在二聚体分析的这个页面里面，去分别查看自身二聚体，和引物对二聚体的结果。到了这一步，不能只是去看软件给出来的那个提示等级，还要去看一看互补发生的位置。如果互补的情况，主要是出现在了5’末端，那么它所造成的影响，通常来说，是会小一些的；可要是集中在了3’末端，特别是末端出现了连续的互补，那就要非常小心了，因为这一类的结构，是更加有可能被延伸，从而形成引物二聚体的产物的。

3、结合着Tm值和GC含量一起去做判断

二聚体的评分，是不能脱离了Tm值和GC含量，去单独看待的。引物的GC含量过高、3’末端的G或者C过多、引物本身的长度太长，这些情况，都有可能会让二级结构，变得更加稳定。反过来讲，如果为了降低二聚体的风险，而把引物改得太短，导致Tm值太低了，那么这也会影响到它的特异性，和扩增的效率。所以说，在检查二聚体的时候，需要同时去看Tm值、GC含量、有没有发卡结构，还有目标区域的特性。

二、Oligo引物二聚体评分过高怎么办

当二聚体的评分偏高的时候，不太建议只是改动一两个碱基，去碰一碰运气。需要先去看一下，风险主要集中在哪个位置上，然后再去决定，是微调一下引物、还是把引物的区域给挪动一下，又或者，是整对引物，都需要重新进行设计。

1、优先去处理3’末端的互补

如果评分之所以高，主要就是来自于3’末端的互补，那就要优先去调整3’末端附近的碱基，或者是把引物的位置，给移动一下。3’末端，它是延伸开始的地方，连续互补的情况越是明显，形成有效二聚体的风险，也就越高。在必要的时候，可以把正向引物，或者反向引物，往上游，或者下游，移动几个碱基，去避开那些末端互补的区域。

2、把连续互补的长度，给它降下来

如果两条引物之间，存在着比较长的连续互补区域，那就可以通过微调引物的长度、改变起止的位置、减少局部GC集中的情况，来处理这个问题。到了这一步，倒也不是要把所有的互补都给清除掉，而是要降低那些比较稳定的互补结构，特别是要减少末端的连续配对。在调整过后，需要重新去检查一下，目标扩增片段的长度、Tm值的差异，还有特异性，不能只是为了把二聚体的评分给降下来，反而把扩增的效果，给牺牲掉了。

3、把问题比较严重的那条引物，重新设计一下

如果某一条引物，它同时存在着自身二聚体评分高、有较高的发卡结构、GC含量也偏高，而且特异性又不够理想，这好几个问题，那么在这种情况下，继续去小修小补，意义就不是很大了。一个更好的做法，是换一个设计的区域，重新去生成一批候选的引物，然后再从这好几组候选里面，去筛选出一组，Tm值比较接近、GC含量也适中、二聚体风险又比较低的引物来。

三、Oligo引物二聚体结果怎么结合实验判断

软件给出来的预测，只不过是一种预测，它并不等于最终的实验结果。在真实的PCR反应里面，退火的温度、镁离子的浓度、引物的浓度、模板的用量，还有循环的次数，这些东西，都会影响到二聚体的形成。当评分偏高的时候，要是目标引物，是必须要去使用的，那么就需要通过实验的条件，继续去进行优化。

1、把退火的温度优化一下

适当地把退火的温度，提高一些，这样就能够减少那些非特异性的结合，和一部分二聚体的形成。在做梯度PCR的时候，可以同时去观察一下，目标条带，还有那些低分子量的二聚体条带，然后去选择一个，目标条带比较清楚，而杂带又相对较少的温度。

2、把引物的浓度降低一些

引物的浓度，要是太高了，就会增加引物彼此之间相互碰到，然后结合在一起的几率。要是出现了比较明显的小片段条带，或者是在qPCR的低温区，看到了熔解峰，那就可以试着，把引物的浓度稍微降低一些，然后再去观察一下，扩增的效率，是不是还能够满足实验的要求。

3、把筛选的记录保留下来

在最终确定引物的时候，最好是能够把候选的序列、Tm值、GC含量、二聚体的检查结果，还有实验验证的记录，都给保留下来。这样一来，到了后续，要是扩增出现了异常，就可以回过头去判断一下，这到底是设计的问题、反应体系的问题，还是模板质量的问题。

总结

Oligo引物二聚体应当怎样去检查，以及引物二聚体评分过高的时候又该怎样去处理，这里面的关键，是不能只是去看一个总的评分，而是要去重点关注，自身的二聚体、引物对之间的二聚体，还有3’末端的互补情况。当评分偏高的时候，应当先去处理3’末端连续的互补，然后再通过移动引物的位置、调整它的长度、降低局部GC的含量，或者是重新设计，去把风险给降下来。软件给出的预测，和实验的具体条件，是需要放在一起去看待的，到了必要的时候，还可以再去通过退火的温度、引物的浓度，还有反应体系的优化，去验证最终的效果。