技术问题

引物长度、GC含量和退火温度都符合设计要求，实际扩增时仍可能出现条带偏弱、扩增效率不稳定或重复性差，这类情况与引物自身折叠有关。内部互补碱基形成茎环后，会占用原本用于模板结合的序列，3′端被卷入结构时影响更明显。分析Oligo怎么检查引物发卡结构Oligo引物发卡结构评分过高怎么办，需要把结构位置、Hairpin Tm、ΔG和整组引物参数放在一起判断。

Oligo引物二聚体应当怎样检查，以及引物二聚体评分过高的时候又该怎样处理，这两个问题，在进行PCR、qPCR和测序引物设计的时候，是很常见的。引物二聚体这个问题，并不是单纯地“软件给出的提示不太好看”，它会和目标模板，去竞争反应体系里面的引物、酶，还有dNTP，要是情况比较严重，就会导致非特异性的条带出现、扩增的效率下降，或者是在qPCR的熔解曲线上，出现不太正常的小峰。在检查的时候，不能只是去看一个总的评分，而是需要把自身二聚体、互补二聚体、3’末端的互补情况，还有ΔG这些结果，放在一起进行判断。

Oligo引物设计应当怎样设置，以及引物Tm值出现偏差时又该怎样去调整，这两个问题，在进行PCR、qPCR或者测序引物设计的时候，是经常会遇到的。设计引物这件事，不能只是去看软件自动给出的那几条推荐序列，还需要结合扩增的目标区域、产物的长度、GC含量、是否形成二聚体、有没有发卡结构，还有反应所用的体系，一起去做出判断。OLIGO 7这个工具本身，是支持PCR引物、测序引物、探针、多重PCR，还有实时PCR这些相关的设计和分析的，只不过软件给出的结果，仍然需要结合具体的实验条件，去进行复核。

设计PCR引物的时候，要是只盯住GC含量这么一个百分比，那很容易会把事情想简单了。在Oligo里面，查看GC含量具体该怎么操作，碰到GC含量太高又该怎么往下调，这两件事还得把Tm值、引物长度、3‘末端的稳定性，还有会不会形成二级结构，都拢到一块儿去判断才行。下面就以Oligo 7这个版本来讲一讲，其它版本菜单的位置也许会有一点点出入。Oligo本身可以拿来设计PCR引物，也可以设计测序引物和探针，顺带着还能帮你去查看引物序列的碱基组成、熔解温度，以及那些悄悄藏着的二级结构。

很多人以为，探针设计不过是从目标序列里选一小段寡核苷酸，但真正动手后，却常常碰到信号强度不够、背景偏高、同源区错配以及不同批次结果波动大这类麻烦。那么，在Oligo这款软件里，究竟该怎样去设计探针，以及在探针特异性不够理想时又该怎么优化呢？处理这些问题，需要把目标区间、解链温度、GC含量、二级结构和同源序列等因素综合起来考虑。按照Oligo 7手册的说法，特异性是评估引物和杂交探针质量的一个关键指标，同时软件也给出了像杂交探针、共有序列探针、TaqMan探针等多种搜索途径。

做多重PCR时，最容易出问题的不是单条引物本身，而是把几对引物放到同一管以后，退火温度对不上、扩增片段挤在一起、引物之间互相配对，最后要么条带乱，要么某几个位点根本起不来。Oligo 7本身就支持自动选择multiplex primers，也支持批量搜索多个序列并把选出的引物集合再做multiplex兼容性分析，所以它更适合先把候选引物成批筛出来，再去做成组验证，而不是一对一对手工试。多重PCR设计里，相近的Tm和可区分的扩增片段长度是基础条件，而所有引物组合的交叉二聚体也必须提前检查。