技术问题

Oligo搜出几十对引物，排在前面的却没有覆盖目标区域；换一套参数后，结果又一对不剩。遇到这种情况，不必急着降低全部筛选标准。模板选得是否正确、搜索区间怎样划定、软件有没有自动放宽条件，都可能影响结果。下面以Oligo 7的普通PCR引物设计为例，介绍搜索过程及候选引物的复核方法。

PCR实验中，引物设计通常需要经过多轮筛选，并不是输入序列后直接采用软件生成结果。实际使用Oligo设计引物时，经常会遇到一些情况，例如目标区域无法生成合适引物、正反向引物参数差异较大、候选序列集中在不适合的位置等。这些问题很多时候和设计参数有关。Oligo能够根据设置条件筛选候选引物，但参数范围设置不合理时，软件输出结果也会受到影响。本文介绍Oligo设计引物的基本流程，并说明参数设置错误导致设计结果异常时的调整方法。

Oligo可以对引物、探针和其他寡核苷酸计算GC含量、Tm、二聚体、二级结构和内部稳定性等参数。GC比例偏高时，Tm往往也会上升，同时更容易形成稳定的局部结构，因此不能只盯着GC百分比单独修改。分析时可以先查看当前序列的GC和Tm，再结合3'端组成、Hairpin以及Dimer结果判断哪些碱基适合调整。

引物长度、GC含量和退火温度都符合设计要求，实际扩增时仍可能出现条带偏弱、扩增效率不稳定或重复性差，这类情况与引物自身折叠有关。内部互补碱基形成茎环后，会占用原本用于模板结合的序列，3′端被卷入结构时影响更明显。分析Oligo怎么检查引物发卡结构Oligo引物发卡结构评分过高怎么办，需要把结构位置、Hairpin Tm、ΔG和整组引物参数放在一起判断。

Oligo引物二聚体应当怎样检查，以及引物二聚体评分过高的时候又该怎样处理，这两个问题，在进行PCR、qPCR和测序引物设计的时候，是很常见的。引物二聚体这个问题，并不是单纯地“软件给出的提示不太好看”，它会和目标模板，去竞争反应体系里面的引物、酶，还有dNTP，要是情况比较严重，就会导致非特异性的条带出现、扩增的效率下降，或者是在qPCR的熔解曲线上，出现不太正常的小峰。在检查的时候，不能只是去看一个总的评分，而是需要把自身二聚体、互补二聚体、3’末端的互补情况，还有ΔG这些结果，放在一起进行判断。

Oligo引物设计应当怎样设置，以及引物Tm值出现偏差时又该怎样去调整，这两个问题，在进行PCR、qPCR或者测序引物设计的时候，是经常会遇到的。设计引物这件事，不能只是去看软件自动给出的那几条推荐序列，还需要结合扩增的目标区域、产物的长度、GC含量、是否形成二聚体、有没有发卡结构，还有反应所用的体系，一起去做出判断。OLIGO 7这个工具本身，是支持PCR引物、测序引物、探针、多重PCR，还有实时PCR这些相关的设计和分析的，只不过软件给出的结果，仍然需要结合具体的实验条件，去进行复核。