Oligo怎么设计引物 Oligo引物设计结果不符合要求怎么办

Oligo搜出几十对引物，排在前面的却没有覆盖目标区域；换一套参数后，结果又一对不剩。遇到这种情况，不必急着降低全部筛选标准。模板选得是否正确、搜索区间怎样划定、软件有没有自动放宽条件，都可能影响结果。下面以Oligo 7的普通PCR引物设计为例，介绍搜索过程及候选引物的复核方法。

一、Oligo怎么设计引物

开始前先明确扩增用途。用于测序、普通PCR或实时PCR的引物，筛选重点并不完全相同。模板也要与实验材料对应，不能拿转录本上的产物长度直接推断基因组DNA的扩增结果。

1、核对模板与扩增区域

检查序列来源、版本和目标位置，尤其留意是否截掉了引物可选区域。若只保留目标片段本身，两端没有合适的结合位置，再严格的搜索也找不出符合要求的组合。

①点击【File】→【Open】，打开目标序列。

②点击【Search】→【Primers and Probes】，在【PCR Primers】下选择【Compatible Pairs】。

反向引物应按合成时的5′至3′方向记录。不要直接复制模板上对应位置的文字，代替软件给出的反向引物序列。

2、限定搜索位置和产物长度

区间限制最好围绕实验目的设置。例如必须覆盖某个位点，就要确认它位于两条引物之间；仅限制产物长度，不能保证目标位置一定包含在内。

①在搜索窗口点击【Ranges】，设置正、负链的候选搜索区间及PCR产物长度范围。

②若按已标注区域搜索，点击【Check Region(s)】，选择目标区域，再勾选【Find products in checked region(s)only】。

区间过窄时，合适的引物可能刚好落在边界外。放宽前先检查坐标，避免把序列截取后的相对位置与原始序列位置混用。

3、设置条件并查看候选组合

引物长度、Tm、二级结构等条件需要相互协调。盐浓度和引物浓度也会影响热力学计算，应尽量与拟采用的反应条件对应。

①点击【Parameters】，检查【Constraints】、【More Constraints】及相关计算条件。

②返回搜索窗口点击【Search】。

③在【Oligonucleotide Sets】中点击【Product Length】或【Score】排序，双击候选组合打开【PCR】窗口。

二、Oligo引物设计结果不符合要求怎么办

把“不符合要求”说清楚，调整才有方向。没有候选、位置不对、引物间Tm不协调，或二聚体风险较高，分别对应不同的检查项，不宜一次修改所有参数。

1、没有候选时，查清限制卡在哪里

先看搜索范围和产物长度能否同时满足，再检查引物长度、Tm及序列约束。某些区域重复较多或碱基组成偏斜，候选空间本来就有限，继续收紧条件只会更难找到组合。

①点击【Ranges】，核对两条引物可选位置与产物长度是否冲突。

②点击【Parameters】，依次检查【Sequence Constraints】、【Constraints】和【More Constraints】。

③每次仅调整一类条件，返回点击【Search】，比较候选数量与位置变化。

需要扩大区间时，应保持必须覆盖的位点不变。若实验要求的边界不能移动，也可以保留“当前条件下未找到合适候选”的判断。

2、有候选时，确认搜索条件有没有改变

Oligo可以在找不到兼容组合时自动降低搜索严格度。因此，搜到了结果，不代表它仍满足最初设置的全部标准。评分靠前，也只说明它在当前搜索和评分规则下更占优势。

①点击【Search】→【Primers&Probes Search Data】，查看最终搜索严格度。

②返回【Parameters】，检查【Automatically change stringency】；不允许自动调整时取消勾选。

③对必须保持的条件，点击相应参数旁的锁图标，将其锁定后重新搜索。

三、确定候选后还要复核哪些细节

候选数量少下来后，可以逐对查看。产物位置正确只是其中一项，还需要检查两条引物是否相互干扰，以及分析范围能否覆盖实际模板中的非目标序列。

1、查看二聚体发生在什么位置

两条引物总体Tm接近，仍可能在3′端形成互补。查看结构时，应连同配对位置、稳定性和具体反应条件一起判断，不能只拿一个ΔG数值作统一淘汰线。

①选中候选引物，点击【Analyze】→【Duplex Formation】，检查自身及引物间的配对。

②点击【Analyze】→【Hairpin Formation】，查看发夹结构，留意是否影响结合区域。

2、确认非特异性检查覆盖了哪里

如果导入的只是几百个碱基，软件在这段序列中没有发现明显误引发位点，也不能证明引物在整个基因组中唯一。实际样本还可能包含同源基因、其他转录本或载体序列。

①点击【Analyze】→【False Priming Sites】，查看当前活动序列两条链上的潜在结合位置。

②返回【Analyze】→【PCR】，核对所选引物的位置与预期产物。

需要判断更大背景中的特异性时，还应使用相应参考数据库补充检索，并记录数据库和序列版本。

3、下单前对照一次最终序列

设计记录与合成订单应逐项对应，包含引物名称、5′至3′序列、模板版本和预期产物长度。若后来添加接头、酶切位点或其他尾序列，要对完整合成序列重新检查二级结构，同时区分尾序列与模板结合部分，避免沿用修改前的分析结果。

总结

Oligo给出的候选需要结合实验用途筛选。搜索阶段保留必要限制，结果出来后再核对位置、结构和特异性，可以减少只看评分带来的遗漏。软件预测的退火条件仍需在实际反应体系中验证，出现异常条带或扩增不足时，也要把模板质量和反应条件一起检查。希望这些方法能帮助大家更有依据地选择引物；有相关使用需求，欢迎联系交流。